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 用于快速缺失內(nèi)源性人蛋白的可選擇的一步PCR介導(dǎo)的降解因子整合方法

科羅拉多大學(xué)醫(yī)學(xué)院科學(xué)家Ryan M. Sheridan和David L. Bentley開發(fā)了一種選擇性的基因盒，它采用CRISPR/Cas9基因編輯器使內(nèi)源性的人蛋白的C端標(biāo)記大腸桿菌二氫葉酸還原酶（eDHFR）降解因子。這個(gè)基因盒可以利用框內(nèi)自我剪切2A多肽和嘌呤霉素抗性基因方法進(jìn)行率正確整合。PCR擴(kuò)增供體的eDHFR基因盒片段，每個(gè)片段末端帶有100bp同源片段，它們通過以向?qū)?/span>RNA為目標(biāo)的可以切割3’端開放性閱讀框的雙鏈DNA同源定向修復(fù)的方法被整合。據(jù)此原理，Ryan M. Sheridan和David L. Bentley生成了含有eDHFR降解因子標(biāo)簽的三個(gè)內(nèi)源性蛋白的細(xì)胞。當(dāng)從培養(yǎng)基中去除抗生素甲氧芐氨嘧啶時(shí)，在2-4小時(shí)就缺失了90%以上每個(gè)帶有eDHFR標(biāo)簽的內(nèi)源性蛋白，這種缺失可以通過再次加入甲氧芐氨嘧啶得到恢復(fù)。嘌呤霉素的選擇性可以利用100bp同源性片段率回收框內(nèi)降解因子融合體。該方法可以適用于生成全基因組范圍的突變細(xì)胞庫(kù)。

原文：

Ryan M. Sheridan and David L. Bentley, Selectable one-step PCR-mediated integration of a degron for rapid depletion of endogenous human protein, BioTechniques 60:69-74 (February 2016)